Флуоресцеїн використовується в лабораторних, біохімічних дослідженнях, органічному синтезі, косметичній та медичній промисловості.
Флуоресцеїн відноситься до групи триарилметанових (ксантенових) барвників; фарбує в жовтий колір шовк та шерсть.
Флуоресцеїн широко використовується для підфарбовування шампунів, пін та солей для ванн, води в акваріумах та водоймах, інших декоративних цілей. Часто його вшивають у тканину рятувальних жилетів - при попаданні такого жилета у воду утворюється величезна яскраво-зелена пляма, добре помітна з літака.